ET菌株的基因組序列。C.phytofermentans ET菌株基因組相對于WT菌株含有12個變異（表2），比具有相似乙醇抗性的C.thermocellum ET基因組（有200至500個變化）少得多（9）。雖然乙醇抗性可能是一個復雜的、多基因性狀，但ET菌株基因組中數量較少的變化揭示了可能在乙醇耐受性中具有功能作用的DNA變異。12個突變中有兩個位于編碼轉錄調節因子的基因中，這些因子可能引起廣泛的基因表達變化：PolB（DNA指導的RNA聚合酶的β亞基）和一個LysR調節因子Cphy3040。LysR型調節因子通常與其靶點共定位于基因組中（28），編碼Cphy3040的基因與編碼NAD依賴性醛脫氫酶的基因相鄰，表明該調節因子與醇形成有關。
乙醇增加細胞膜的通透性，導致代謝物毒性泄漏出細胞（29）。因此，乙醇抗性通常涉及膜修飾，例如改變的蛋白質含量（8）或更長的鏈脂肪酸和更多的縮醛磷脂（30），以增加膜剛性來減輕乙醇的流體化效應。ET菌株在Cphy0233的推定酰基-受體結合口袋（NCBI登錄號cd07989）中有一個D80N變化，Cphy0233是C.butyricum PlsD的同源物，PlsD在磷脂生物合成中將脂肪酰基轉移到甘油-3-磷酸的sn-1位置（31）。Cphy0233突變因此可能通過改變摻入磷脂的脂肪酸來合成更剛性、耐乙醇的細胞膜。
ET菌株在膜結合Rnf復合物的RnfA亞基中有一個C26S突變，該復合物耦合H+（32）或Na+（33）外流與電子從還原型鐵氧還蛋白轉移到NAD+（34）。產生的電化學梯度被F0F1 ATP酶利用用于ATP合成。C.phytofermentans Rnf復合物（Cphy0211至Cphy0216）和F0F1 ATP酶（Cphy3735至Cphy3742）在所有測試的碳源上均高表達（19），并且可能對能量保存很重要，類似于C.ljungdahlii（32）。然而，Rnf產生NADH，這可能不能被ET菌株耐受，因為ET菌株無法通過AdhE介導的乙醇形成來重新氧化NADH（見下文）。因此，C26S RnfA變體可能使Rnf復合物功能受損，這犧牲了ATP生產，但可能通過平衡細胞NADH/NAD+比率而使ET菌株受益。
ET菌株在兩種推定涉及陽離子穩態的轉運蛋白中也有突變。Cphy0543與MgtA同源，MgtA是一種P型ATP酶，在低環境Mg2+濃度下上調（35），以介導Mg2+攝取（36）或Ca2+/Mg2+反向轉運（37）。Cphy3780，一個ABC轉運蛋白的膜組分（PFAM登錄號PF06182），似乎與Cphy3780，一種ABC型Na+外排蛋白（NCBI登錄號cd03267）共轉錄。在枯草芽孢桿菌中，這種Na+外排系統被乙醇誘導，并被提議用于補償由于膜屏障減弱導致的細胞外Na+內流（38）。這些陽離子轉運蛋白中的變異可能增加其活性以減輕乙醇脅迫導致的陽離子泄漏。
AdhE活性。ET菌株在Cphy3925 AdhE中有一個G609D變體，Cphy3925是一種推定的乙醛-CoA脫氫酶和醇脫氫酶（ADH）。G609D突變位于C末端ADH結構域（NCBI登錄號cd08178）活性位點的保守位置。先前的一項研究報道了一株乙醇耐受的C.thermocellum菌株，其AdhE突變（P704L和H735R）將輔因子特異性從NADH轉變為NADPH，這被提議通過改變內部氧化還原平衡來賦予乙醇抗性（9）。為了確定G609D突變對Cphy3925酶活性的影響，我們純化了WT和ET版本的酶（圖3A），并測試了它們使用NADH或NADPH輔因子體外催化乙酰-CoA轉化為乙醇的兩步、雙向反應。
突變的Cphy3925失去了NAD（H）依賴性活性，但與C.thermocellum中的突變AdhE不同，G609D突變并未導致NADPH依賴性ADH活性（圖3B至E）。相反，我們的結果支持ET菌株中止了AdhE介導的乙酰-CoA、乙醛和乙醇的相互轉化，這有助于解釋為什么C.phytofermentans ET菌株具有較低的乙醇產量。AdhE功能喪失可能通過降低細胞內乙醇及其高毒性前體乙醛的水平來減輕乙醇脅迫。C.phytofermentans除了Cphy3925外還編碼四個鐵依賴性ADH以及一個鋅依賴性ADH。所有6個ADH均表達，并且Cphy3925和Cphy1029是在所有測試碳源上表達量最高的蛋白質之一（19,39）。因此，C.phytofermentans可能通過多個ADH的協同作用產生乙醇，而這些其他ADH，特別是Cphy1029，負責ET菌株產生的乙醇。
乙醇途徑工程。為了增強ET菌株的乙醇生產，將來自Zymomonas mobilis的由丙酮酸脫羧酶（Pdc）和醇脫氫酶（AdhB）組成的替代乙醇生產途徑（圖4A）通過復制型pQexpE質粒（圖4B）轉移到C.phytofermentans中。這些酶共同將丙酮酸脫羧與乙醇偶聯，并氧化NADH，因此代表了AdhE乙醇形成途徑的替代方案。我們選擇表達外源酶而不是WT拷貝的Cphy3925，因為AdhE會形成多聚體（40），因此突變型AdhE在部分二倍體中可能具有顯性負效應。
pQexpE的表達使WT和ET菌株的纖維素分解增加了約30%（圖5A），并將乙醇產量相對于ET菌株提高了70%（P<0.01），從而將乙醇產量恢復到WT水平（圖5B）。在表達pQexpE的WT和ET菌株中，CO2產量相對于H2產量不成比例地增加（表3）。CO2合成升高可能是由于Pdc酶催化的丙酮酸脫羧增加。先前的結果表明，Pdc/AdhB表達增強了WT C.cellulolyticum的纖維素分解和乙醇生產，這被提議是由于消耗了過量的丙酮酸，否則會導致代謝停滯（14）。表達Pdc/AdhB的C.phytofermentans代謝（纖維素分解以及CO2和乙醇產生）增加可能是由于緩解了過量丙酮酸的抑制。或者，糖酵解酶的表達或活性可能受NADH水平調節，使得Pdc/AdhB對NADH的再氧化刺激了糖酵解，從而導致底物利用增加。
結論
在本研究中，我們通過分離、表征和工程化一株乙醇耐受性（ET）的Clostridium phytofermentans菌株，探究了微生物乙醇耐受性的遺傳基礎及表型后果。ET菌株比野生型菌株能在更高的乙醇濃度下生長（圖1），并且能在7%的環境乙醇濃度下持續產乙醇（圖2C），但其生長（圖1）和乙醇產量（圖2A）相較于野生型有所受損。ET菌株的基因組測序揭示了涉及代謝多個方面的基因中存在12個突變（表2），包括雙功能乙醛CoA/醇脫氫酶AdhE中的一個G609D變體，該變體使其活性喪失（圖3）。我們通過在pQexpE質粒上表達Zymomonas mobilis的丙酮酸脫羧酶（Pdc）和醇脫氫酶B（AdhB）來補充ET菌株中的AdhE突變（圖4），這促進了底物轉化（圖5A）并恢復了乙醇生產（圖5B）。
需要進一步的工作來提高C.phytofermentans的植物生物質降解和乙醇形成速率及產物濃度。最近，通過實驗進化改善C.phytofermentans在纖維二糖、纖維素和木聚糖上的生長，也獲得了能更快生產乙醇的菌株（41）。本文提出的ET菌株基因組序列暗示了其他可能改善乙醇耐受性和生產的新的潛在方法。例如，我們的結果表明，關于乙醇抗性的進一步研究應側重于PlsD介導的脂肪酸摻入磷脂、LysR調節的基因表達模式、過表達Rnf復合物以刺激AdhE介導的乙醇生產，以及防止陽離子泄漏。
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